Z6·尊龙凯时的研究表明，糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，且是大部分生物制药的关键成分。蛋白质的糖基化作为最普遍且复杂的翻译后修饰（PTM）之一，对调节多种生物过程至关重要。因此，对糖蛋白的一级序列进行综合分析，包括糖基化位点的识别和相关聚糖结构的研究，成为探讨其功能的关键所在。

液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）现已成为识别蛋白质及其翻译后修饰的重要工具。不同于传统数据库搜索策略，蛋白质从头测序（de novo sequencing）作为一种新兴方法，不需要预先了解DNA或氨基酸序列。然而，糖基化位点的复杂性往往会导致序列覆盖的不完整性和游离寡糖修饰谱的模糊，进而使得获取信息丰富的糖肽碎裂谱，支持从头测序的过程变得困难。这造成了在单克隆抗体（mAb）中，因某些区域间隙的普遍情况，而限制了从头测序的应用。

在2025年发表于JACSAu的研究“解码蛋白质糖基化：基于质谱的综合从头测序策略”提出了一种创新方法，通过结合糖基释放介导的从头测序和糖基化位点的表征，致力于识别未知糖蛋白。作者利用N-/O-糖的去糖基化，保障了全面的序列覆盖，结合EThcD碎裂技术，有效获得高质量的长肽，以提高蛋白质组装的准确性。这种方法被应用于复杂糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种未知序列的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示其一级序列的微小差异。此外，研究者在亚基、糖肽及聚糖水平上，对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了详细特征分析。

该策略有效弥补了从头测序与糖基化修饰之间的差距，提供了关于糖蛋白一级结构和糖基化修饰的全面信息。此方法，不仅在基础研究中具有实用价值，还对生物制药行业的应用意义深远。

研究的方法包括：首先，利用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶，以确保去糖基化的有效性，并通过完整质量分析确认去糖基化的效果。其次，采用电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术获取高质量的肽段，并使用PEAKSAB软件分析其序列。此外，通过在含18O的环境下进行PNGaseF酶解，将糖基化的Asn转化为Asp并进行标记，以实现对N糖基化位点的定量分析。最后，使用内切糖苷酶混合物处理样本，并通过pFind分析糖苷酶处理后的质谱数据，以确认带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，从而验证N-糖基化位点的鉴定结果。

在这项研究中，作者提出了一种基于综合质谱法的蛋白质糖基化从头解码策略，利用具有唾液酸化N聚糖和O聚糖的常用模型糖蛋白Fetuin-A开发了该方法。通过糖苷酶水解糖苷键以简化质谱分析，通过从头测序过程获得去糖基化蛋白的一级序列。紧接着，利用高度复杂的糖基化生物制药依那西普验证了该方法的有效性。随后，该策略揭示了三种未知TNFR：Fc融合生物制剂的氨基酸序列，并探讨了它们与原研药物依那西普的相似性。研究者从多个层面对糖基化进行了特征分析，包括N-糖基化位点的鉴定、游离寡糖的分析、糖蛋白亚基和糖肽的分析，从而精确定位了N/O糖基化的情况。

研究结果显示，采用PNGaseF和O-糖苷酶EngEF的联合去糖基化处理，显著提高了酶解后序列的覆盖率，且胰凝乳蛋白酶、Glu-C、胃蛋白酶及其他酶的序列覆盖率均达到90%以上，为后续的糖蛋白测序打下了基础。通过EThcD技术，研究者不仅获得了更为优质的肽段，提高了蛋白质的拼接和序列覆盖度，进一步证明了EThcD技术在糖蛋白从头测序中的优势。

为评估方法的可靠性，研究者对已上市的高糖基化Fc融合蛋白依那西普进行了测序，结果显示其具备多个N和O-糖基化位点。此外，对三种新(sequence unknown)的TNFR:Fc生物制剂进行测序时发现，这些药物的氨基酸序列与依那西普存在细微的差异，具体体现在某些突变位点上，充分体现了该方法在生物药物分析中的有效性。

关于N和O-糖基化的分析，研究者采用了多层次的方法，包括针对N-糖基化位点的鉴定、游离寡糖的分析，以及对糖蛋白亚基和糖肽的深度探讨。这一系列分析揭示了依那西普和三种未知TNFR:Fc融合生物制剂在特定氨基酸位点上的糖基化异质性，以及它们在特定区域的糖型分布差异，展现出一种新颖的糖基化特征分析方法。

基于质谱的蛋白质从头测序技术，结合糖苷酶酶解和EThcD碎裂技术，显著提升了蛋白质测序的精确度及糖基化特征的解析能力。此项新策略为深入理解高度糖基化蛋白质开辟了新的研究方向，并为生物制药的成功分析提供了坚实的基础，尤其是针对各类疾病治疗相关的生物药物分析。

综上所述，通过Z6·尊龙凯时的研究和探讨，我们对糖基化的复杂性有了更深刻的理解，这对建立有效的生物药物分析框架具有重要意义。